【安格斯◆技术】人工授精+胚胎移植技术在肉牛一胎双犊实践中的应用

现代畜牧业中，优质肉牛的繁育速度对提升产业效益和满足市场需求至关重要。然而，传统肉牛繁殖方式存在局限性，有较长的妊娠期和以单胎为主的繁殖特点，双胎出生率仅为1%~2%，难以满足优质肉牛需求的快速增长需求［1］。这不仅限制了优质遗传基因的扩散，也阻碍了肉牛产业的规模化和高效化发展［2］。因此，如何提高双胎出生率已成为肉牛繁育领域亟待突破的技术瓶颈。过去虽有尝试通过外源激素促使母牛发情后排出两个卵子，再经人工授精实现双胎受孕，但由于激素用量难以精准控制及多胎妊娠带来的高风险，这种方法在实际生产中难以大规模应用［3］。还有研究者尝试在母牛发情后第7天同时移植2枚胚胎或对胚胎进行分割及利用体外受精胚胎，虽能实现双胎受孕，但因成本高、受胎率低等原因无法在生产中推广［4］。

近年来，随着繁殖技术的发展，人工授精技术和胚胎移植技术逐渐成为提升肉牛繁殖效率的重要手段。人工授精技术自20世纪初出现以来，被誉为牛繁殖技术的第一次革命，如今已广泛应用；胚胎移植技术自20世纪70年代兴起，作为牛繁殖技术的第二次革命，也越来越受牛场青睐［5］。然而，在母牛繁殖实践中发现，这两项技术通常是不同技术人员对不同母牛操作，互不相关。母牛发情后排出的卵子可通过人工授精成功受孕，此时子宫处于待孕状态，胚胎处于游离状态，为胚胎移植提供了良好条件，可实现双胎受孕。此外，母牛有2个子宫角，每个子宫的伸缩容积足够容纳两个胎儿生长发育。本试验创新性地将人工授精技术和胚胎移植技术实施在同一头母牛上，探索是否可以实现母牛一个情期双胎受孕。期望通过这一技术手段突破传统繁殖模式的限制，提高优质肉牛的繁育速度，为肉牛产业的可持续发展开辟新道路，推动行业迈向更高水平。

1.1　供体、受体牛的选择

在长春市皓月集团绿园区牛场，采用观察法和直肠检查法，从沃金黑牛和荷斯坦母牛群体中挑选37头2~3岁未孕且无繁殖机能疾病个体。其中，6头体型外貌较为出众的沃金黑牛为供体母牛，31头（10头沃金黑牛和21头荷斯坦牛）为受体母牛。

1.2　主要仪器与试剂

体视显微镜（日本尼康株式会社）、采胚管（德国米尼图）、集卵杯（日本富士平公司）、输精枪、移植枪、长臂手套、注射器等。

控释栓（CIDR，EUROAPI）、促卵泡素（FSH，北京百奥莱博科技有限公司）、前列腺素（PG，上海崇达生物科技有限公司）、冲胚液（Bioniche）、生源（GnRH，宁波第二激素厂）、雌二醇（E2，宁波第二激素厂）、牛孕酮ELISA试剂盒（上海乔羽生物科技有限公司）、维生素AD（宁波第二激素厂）等。

1.3　供体牛处理

第0 天放栓（CIDR），肌内注射10 mL维生素AD，1 mL E2，开始同期发情处理；第5~6 d每天早晚各肌内注射一次FSH（第5 天：早晚FSH各2.5 mL；第6 天：早晚FSH各2 mL）；第7 天早晚各肌内注射一次FSH和PG（FSH 1.5 mL，PG 0.6 mg）；第8 天早上肌内注射1 mL FSH，撤栓，冲洗阴道，晚上肌内注射1 mL FSH和10 mL维生素AD；第9 天观察发情情况，对发情牛当晚用沃金黑牛冻精进行人工授精，并注射GnRH；第10 天早上进行第二次人工授精；第16 天采用非手术法冲胚。

1.4　受体牛处理

第0 天放栓（CIDR），肌内注射10 mL维生素AD，开始同期发情处理；第5 天注射0.6 mg PG、10 mL维生素AD；第8 天撤栓；第9～11 d观察发情情况并记录，同时用沃金黑牛冻精进行人工授精；第16 天进行胚胎移植。

1.5　冲胚与移植

在第16 天，冲胚和胚胎移植同步进行。操作前，先对供体牛和受体牛进行直肠清粪，并检查其卵巢上的黄体发育状况，以确定是否进行冲胚及胚胎移植。冲胚液需提前加热至35 ℃。使用集卵杯收集胚胎，随后在体视显微镜下进行胚胎挑选，并将优质胚胎收集备用。

1.6　测定项目及方法

1.6.1　同期发情情况

将输精管结扎的公牛置于母牛群中，通过观察母牛对公牛的性欲表现来判断供体、受体母牛的发情状况，并进行统计。

发情率（%）=（发情的供或受体母牛数/观察的供或受体母牛数）×100

1.6.2　黄体检测

隔着直肠壁轻柔触摸供体、受体牛卵巢上的黄体，仔细评估其大小、质地和形状，同时通过ELISA试剂盒对母牛的血液孕酮水平进行精准检测。当黄体直径1~2 cm、质地坚实、表面光滑、形态呈圆形或椭圆形，且血液中孕酮水平处于1~10 ng/mL时，可认定该黄体合格。

黄体合格率（%）=（黄体合格的供或受体母牛数/观察的供或受体母牛数）×100

1.6.3　供体牛胚胎质量检测

参考中华人民共和国国家标准 GB/T 25881—2010［6］。

A级：胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，结构紧凑，色调和透明度适中，胚胎细胞团呈均匀对称球形，胚胎发育阶段与预期发育阶段一致。透明带光滑，不规则的细胞相对较少，变性细胞不高于10%。

B级：轮廓清晰，色调及细胞密度良好，胚胎细胞团的大小和形状以及细胞的颜色和密度存在一定的不规则，有小部分游离细胞，胚胎的发育阶段与预期的发育阶段基本一致，变性细胞的比例为10%~20%。

C级：胚胎细胞团的大小、形状及细胞颜色和密度存在严重不规则。轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或泡液较多，变性细胞的比例为30%~40%。

退化：死亡或退化的胚胎，有碎片，轮廓不清晰，结构松散，变性细胞比例高于50%。

1.6.4　妊娠检查

胚胎移植35 d后，通过B超检查受体母牛妊娠情况，记录妊娠母牛数、未妊娠母牛数、单胎妊娠母牛数、双胎妊娠母牛数，并计算以下指标。

❖妊娠率（%）=（妊娠的受体母牛数/接受胚胎移植的受体母牛数）×100

❖单胎妊娠率（%）=（单胎妊娠的受体母牛数/妊娠的受体母牛数）×100

❖双胎妊娠率（%）=（双胎妊娠的受体母牛数/妊娠的受体母牛数）×100

❖空怀率（%）=（未妊娠受体母牛数/接受胚胎移植的受体母牛数）×100

2.1 供体、受体牛同期发情及黄体检测

7头供体、受体牛中，共有5头供体牛（沃金黑牛）和29头受体牛（沃金黑牛9头、荷斯坦牛20头）表现发情。其中，1头供体牛（沃金黑牛）及2头受体牛（沃金黑牛1头、荷斯坦牛1头）未发情，被淘汰。供体牛发情率为83.33%，受体牛发情率为93.55%，整体发情率为91.89%。进一步检查发现， 5头发情供体牛（沃金黑牛）黄体全部合格，黄体合格率为100%；29头发情受体牛中，28头（沃金黑牛9头、荷斯坦牛19头）黄体符合要求，仅1头（荷斯坦牛）因黄体不合格被淘汰，受体牛黄体合格率为96.55%。综合来看，牛整体黄体合格率为97.06%，见图1 。

图1 供体、受体牛同期发情及黄体检测情况

Fig.1 The synchronized estrus and corpus luteum detection in donor and recipient cow

2.2 供体牛冲胚及胚胎质量检测

5头合格供体牛人工授精后，进行了冲胚操作，具体冲胚结果如表1所示。冲胚共获得44枚胚胎，其中A级胚胎27枚，B级胚胎8枚，C级胚胎3枚，退化胚胎6枚。这些胚胎中，A级和B级胚胎共35枚可被用于后续试验，平均每头供体牛提供7枚优质胚胎。

2.3 妊娠检查

从挑选出的优质胚胎中，将20枚A级胚胎和8枚B级胚胎分别移植到28头受体牛体内，每头受体牛移植1枚胚胎。移植35 d后，通过B超检查受体牛的妊娠情况。结果见表2。23头受体牛成功妊娠，5头未妊娠。其中，双胎妊娠18头，单胎妊娠5头。整体妊娠率为82.14%，双胎妊娠率为78.26%，单胎妊娠率为21.74%，空怀率为17.86%。进一步分析发现，将胚胎移植到卵巢黄体异侧子宫角内的受体牛，双胎妊娠率为78.57%；而移植到卵巢黄体同侧子宫角内的受体牛，双胎妊娠率为77.78%。

在19头荷斯坦牛受体牛中，双胎妊娠13头，单胎妊娠2头、空怀4头，妊娠率为78.95%，双胎妊娠率为86.67%，单胎妊娠率为13.33%，空怀率为21.05%。12头受体牛的胚胎移植在卵巢黄体异侧子宫角内，其中双胎妊娠7头，单胎妊娠1头，空怀4头，双胎妊娠率为87.50%；7头受体牛的胚胎移植在卵巢黄体同侧子宫角内，其中双胎妊娠6头，单胎妊娠1头，双胎妊娠率为85.71%。

在9头沃金黑牛受体牛中，双胎妊娠5头、单胎妊娠3头、空怀1头，妊娠率为88.89%，双胎妊娠率为62.50%，单胎妊娠率为37.50%，空怀率为11.11%。6头受体牛的胚胎移植在卵巢黄体异侧子宫角内，其中双胎妊娠4头，单胎妊娠2头，双胎妊娠率为66.67%；3头受体牛的胚胎移植在卵巢黄体同侧子宫角内，其中双胎妊娠1头，单胎妊娠1头，空怀1头，双胎妊娠率为50.00%。妊娠35 d双胎B超影像见图2。

图2　妊娠35 d双胎B超影像

Fig. 2　Ultrasound images of twin pregnancy in recipient cows at 35 days of gestation

表2　母牛妊娠记录

Tab.2　Gestation records of cows

在自然情况下，适孕母牛在排卵期通常只排出一个卵子，因此一胎一犊是常态。母牛的妊娠期为275~290 d，加上再次受孕前的45 d以上等待期，理论上母牛一年只能产下一犊。然而，当前实际状况是母牛平均每年只能产下0.9胎，约0.8个犊，且只有1%~2%的母牛能够自然产下双胞胎，即“一胎双犊”。母牛怀双胎可以显著提高繁殖效率和养牛经济效益。因此，近年来人们尝试通过遗传选择、药物诱导、激素免疫等方法来提高母牛的双胎率［5-7］。然而，由于双胎这一经济性状的遗传力很低、激素用量难以精准控制、受胎率过低或成本过高等因素，这些方法难以在生产中广泛应用。

人工授精技术被称为牛繁殖技术的第一次革命，通过将优质公牛的精液进行处理和稀释后输送到母牛的生殖道内，使母牛受孕。这种方法可以实现优良基因的广泛传播，提高繁殖效率，并减少因自然交配而可能产生的疾病传播风险。胚胎移植技术则进一步发挥了供体母牛的繁殖潜力，通过将发育良好的胚胎从供体母牛体内取出，移植到其他受体母牛体内，使其继续发育成为新个体。这种方法可以显著提高良种牛的繁殖效率，加速良种牛群的繁育进程［8］。因此，人工授精和胚胎移植技术的结合在现代肉牛繁育中具有显著的优势。然而，目前针对这一领域的相关研究还相对较少。

“沃金黑牛”作为皓月集团的高端牛肉品牌，其牛肉以黄金比例的脂肪分配和独具质感的雪花纹理著称。本试验以沃金黑牛和荷斯坦牛作为受体牛，首先，使用沃金黑牛冻精对受体牛进行人工授精。随后，将经过沃金黑牛冻精授精后的沃金黑牛供体母牛的28枚优质胚胎（A级胚胎20枚，B级胚胎8枚）移植到受体牛的子宫内。前人研究表明，人工授精+胚胎移植法诱发母牛双胎率为60%~70%，本试验母牛双胎率78.26%，高于以往研究数据［9-10］。此外，试验中荷斯坦牛和沃金黑牛受体牛的妊娠率和双胎妊娠率存在差异。具体来看，荷斯坦牛的妊娠率为78.95%，双胎妊娠率为86.67%；而沃金黑牛的妊娠率为88.89%，双胎妊娠率为62.50%。这种差异可能与不同品种牛的生理特征和遗传背景相关。荷斯坦牛作为世界上分布最广、数量最多的奶牛品种之一，以其卓越的泌乳性能和高年产奶量而闻名，同时其适应性也较强。在繁殖性能方面，荷斯坦牛的情期受胎率和产犊间隔等繁殖指标较为理想［11］，这使其在双胎妊娠方面具有一定优势。相比之下，沃金黑牛则以肉质优良和较高的繁殖性能著称［12］。其较高的繁殖性能主要体现在较高的妊娠率和单胎妊娠率上，但双胎妊娠率相对荷斯坦奶牛较低。此外，胚胎移植位置对双胎妊娠结果也有一定影响。在荷斯坦牛中，将胚胎移植到卵巢黄体异侧子宫角内的受体牛，其双胎妊娠率与移植到同侧子宫角内的受体牛相当，分别为87.50%和85.71%。然而，在沃金黑牛中，将胚胎移植到黄体异侧子宫角内的受体牛双胎妊娠率为66.67%，高于移植到同侧子宫角内受体牛的双胎妊娠率（50.00%）。这种差异可能归因于荷斯坦牛和沃金黑牛在卵巢黄体发育、子宫角环境及胚胎着床条件等方面存在不同，进而影响胚胎着床成功率，导致双胎妊娠率存在差异。此外，在这两个品种的受体牛中，移植到卵巢黄体异侧子宫角的受体牛双胎妊娠率高于移植到同侧子宫角的受体牛。这可能与胚胎移植位置对胚胎所处微环境的影响密切相关，移植到卵巢黄体异侧子宫角的胚胎，可能面临更少的竞争压力，并且能够获得更适宜的发育空间，这在一定程度上有利于双胎妊娠的发生。相比之下，尽管移植到黄体同侧子宫角的胚胎可能享有更稳定的激素水平和营养供应，但空间竞争等因素可能会对双胎妊娠的形成产生阻碍作用。

本试验结果表明，“人工授精 + 胚胎移植”在提升受体牛双胎妊娠率方面成效显著。本试验中，不同品种牛胚胎移植位置对双胎妊娠率存在显著影响。总体而言，将胚胎移植到卵巢黄体异侧子宫角内的受体牛，其双胎妊娠率略高于移植到同侧子宫角内的受体牛。随着技术的不断进步，人工授精与胚胎移植技术有望在肉牛产业中发挥更大的作用。通过进一步优化胚胎移植位置和提高胚胎质量评估标准，可以进一步提升双胎妊娠率和繁殖效率。此外，结合基因检测和精准繁殖管理，可以更好地筛选和利用优质遗传资源，加速良种牛群的繁育进程。这将为沃金黑牛产业的规模化和高效化发展提供更有力支持，推动整个肉牛产业高质量、可持续发展。

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［12］孙翠翠.“牛芯片”的破局之路［N］.吉林日报， 2023-07-03（007）.

来源说明

文章来源：黑龙江动物繁殖期刊

文章题目：《人工授精+胚胎移植技术在肉牛一胎双犊实践中的应用》

文章作者：李东